На правах рукописи

Трепаков Алексей Владимирович

Воспалительная реакция в легких до и после операций на сердце у детей первого года жизни
03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

14.00.44 – сердечно-сосудистая хирургия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук
Москва 2008
Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН и Научном центре сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Лидия Константиновна Романова

академик РАМН, доктор медицинских наук,

профессор Лео Антонович Бокерия
Официальные оппоненты:

ведущий научный сотрудник ГУ НИИ Морфологии человека РАМН, доктор медицинских наук, профессор Яглов Валентин Васильевич

главный научный сотрудник НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Чиаурели Михаил Рамазович

Ведущая организация: Московский государственный медико-стоматологический Университет
Защита диссертации состоится «____» октября 2008 года в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.004.01 ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул.Цюрупы, д.3
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул.Цюрупы, д.3
Автореферат разослан «______» сентября 2008г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор медицинских наук Л.П.Михайлова

Актуальность темы

Увеличение в последние годы количества операций по коррекции сложных врожденных пороков сердца (ВПС) у детей первого года жизни обусловлено расширением возможностей ранней хирургической помощи и значительным снижением осложнений, связанных с применением искусственного кровообращения (ИК), искусственной вентиляции легких (ИВЛ), а также с улучшением хирургической техники (Бураковский В.И., Бокерия Л.А. 1996; Абрамян М.А., 2000). Однако, все еще наблюдается значительное количество осложнений, связанных с развитием воспалительной реакции организма в ответ на проведение операции на сердце и сосудах с применением ИК, ИВЛ (Kawai T. et al., 1995; Fenton K.N. et al., 2003; Wright G.E. et al., 2005). Системная воспалительная реакция (СВР) после операции на сердце у детей первого года жизни является неотъемлемой частью изменений, происходящих в организме в результате хирургического лечения. СВР – процесс, обусловленный сложным каскадом взаимодействия гуморальных и клеточных факторов, направленных на восстановление гомеостаза. Развитие СВР включает в себя активацию системы комплемента, нейтрофилов, появление провоспалительных цитокинов и других медиаторов воспаления (Бокерия Л.А., Самуилова Д.Ш. и др., 2004).

Одним из тяжелых осложнений, развивающихся после операции по поводу ВПС, является пневмония, частота которой в послеоперационном периоде по данным зарубежных авторов достигает 14% от числа прооперированных пациентов (Kawai T. et al., 1995; Fenton K.N. et al., 2003; Wright G.E. et al., 2005).

В связи с этим возникает вопрос: является ли воспаление в легких следствием развития СВР или пневмония развивается как самостоятельное послеоперационное осложнение?

Предполагают, что важную роль в активации СВР и развитии дисфункции органов дыхания играют интерлейкин-6 (ИЛ-6) и интерлейкин-8 (ИЛ-8), продукция которых резко возрастает во время операций на сердце в условиях ИК (Бокерия Л.А., Самуилова Д.Ш. и др., 2004). Показано, что длительность проведения ИК, время пережатия аорты, минимальная температура тела во время операции являются факторами риска развития легочных осложнений (Dreyer W.J. et al., 1995; Kotani N. et al., 2000; Бокерия Л.А., Самуилова Д.Ш. и др., 2004). Кроме указанных цитокинов в местной (легочной) воспалительной реакции принимают участие нейтрофильные лейкоциты (Kotani N. et al., 2000). Отмечена тесная связь между возникновением участков пониженной вентиляции легких (гиповентиляции) и характером воспалительного ответа после операции на сердце (Magnusson L. B. et al., 1997).

Результативности выявления воспалительного ответа в органах дыхания во многом способствует использование техники получения бронхоальвеолярного смыва (БАС) (de Blic J. et al., 2000). У детей первого года жизни техника забора БАС недостаточно разработана и имеет свои особенности, связанные с малыми размерами верхних дыхательных путей. Для изучения внутренней среды органов дыхания детей более старшего возраста чаще используется методика небронхоскопического бронхоальвеолярного смыва (Koumbourlis A.S. et al., 1993).

Несмотря на большое количество работ, посвященных изучению системного воспаления после операции на сердце и сосудах у детей, воспалительный ответ органов дыхания изучен недостаточно. В отечественной и зарубежной литературе отсутствует комплексный сравнительный анализ, который бы охарактеризовал местное (легочное) воспаление у детей с ВПС до и после операции.
Цель исследования

Дать сравнительную оценку проявления легочного воспалительного ответа на основании изучения концентрации провоспалительных цитокинов (ИЛ-6 и ИЛ-8) и клеточного состава трахеобронхиальных смывов (ТБС) до и после хирургического лечения ВПС у детей первого года жизни.

Задачи исследования

1. Изучить клеточный состав содержимого воздухоносных путей у детей первого года жизни с ВПС до и после операции на сердце и сосудах.

2. Определить концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 в ТБС из воздухоносных путей и в сыворотке крови у детей первого года жизни с ВПС до и после операции на сердце и сосудах.

3. Провести сравнительный анализ концентраций ИЛ-6 и ИЛ-8 в ТБС и в сыворотке крови у детей первого года жизни с ВПС до и после операции на сердце и сосудах.

4. Выявить особенности местной воспалительной реакции в легких у детей первого года жизни с ВПС до и после операции на сердце и сосудах.

5. Разработать оптимальный способ получения клеток и жидкой среды из воздухоносных путей у детей первого года жизни с ВПС до и после операции на сердце и сосудах.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработан оригинальный катетер с ловушкой для получения ТБС у детей первого года жизни. Этот катетер был нами успешно использован для получения ТБС у детей, оперированных в отделении Экстренной хирургии недоношенных и детей первого года жизни с ВПС НЦ ССХ им.А.Н.Бакулева РАМН. Особенностью конструкции катетера является наличие ловушки малого диаметра, что обеспечивает скопление анализируемого материала в основном на ее дне, а не на стенках. Это дало возможность более полноценно использовать материал, поскольку облегчается перенос содержимого ловушки для последующего исследования.

Проведено всестороннее исследование ТБС и определен его цитологический состав. Впервые выявлено, что в состав ТБС у детей первого года жизни входят альвеолярные макрофаги и моноциты (АМ+Мон), лимфоциты (Л), нейтрофильные лейкоциты (Н), эпителий ротовой полости (Э), клетки бронхиального эпителия (БЭ). Показано, что соотношение клеток в содержимом воздухоносных путей меняется после операции на сердце и сосудах. В частности, отмечено значительное увеличение числа нейтрофильных лейкоцитов в ТБС после операций на сердце и сосудах, что свидетельствует о выраженной воспалительной реакции в легких.

Определены концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 в сыворотках крове и ТБС до и после операции на сердце и сосудах. Впервые показаны различия в концентрациях этих цитокинов у детей первого года жизни, оперированных с использованием ИК и без него. Выявлены различия в концентрациях ИЛ-6 и ИЛ-8 в сыворотке крови и в ТБС до и после операции на сердце и сосудах у детей первого года жизни.

Выполненный впервые анализ ряда важных маркеров воспалительной реакции позволил оценить характер местного воспаления в органах дыхания у детей первого года жизни.

Предложенная методика получения ТБС с помощью оригинального катетера с ловушкой может быть использована для ранней диагностики воспаления в органах дыхания. Это поможет своевременно начать комплекс лечебных мероприятий, направленных на устранение легочной воспалительной реакции.

Представленная оценка воспаления в легких дает возможность для разработки новых способов защиты организма от неблагоприятного воздействия в ходе хирургического вмешательства.

Основные положения, выносимые на защиту

У детей первого года жизни с врожденными пороками сердца непосредственно после операции достоверно возрастает относительное количество нейтрофильных лейкоцитов на 40,09% в трахеобронхиальных смывах по сравнению с дооперационным уровнем. Это свидетельствует о проявлении местной (легочной) воспалительной реакции.

Развитие пневмонии у детей первого года жизни сопровождается в раннем послеоперационном периоде значительным повышением концентрации ИЛ-6 и ИЛ-8 в сыворотке крови, что может служить ранним диагностическим признаком воспаления в легких.

Уровни провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8 в сыворотке крови детей первого года жизни с врожденными пороками сердца возрастают после операции. Это указывает на развитие системного воспаления после операции на сердце и сосудах.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены: на Девятой ежегодной сессии НЦ ССХ им А.Н.Бакулева РАМН (Москва, 2005); на Научной конференции “Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии” ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Москва, 2006); на 20-м Конгрессе Европейского Общества Интенсивной Терапии (Берлин, 2007); на Научно-практической конференции и школе по инфекционной патологии (с международным участием) (Москва, 2007).

Внедрение результатов работы в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в практическую работу кафедры фтизиопульмонологии Российской Медицинской Академии последипломного образования и используются в курсе лекций.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 работы в зарубежной печати, 2 публикации представлены в изданиях, включенных в утвержденный ВАКом “Перечень периодических изданий”.

Объем и структура диссертации

Содержание диссертация изложено на 90 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав, обсуждения результатов собственных исследований, выводов, практических рекомендаций, библиографии, содержащей 74 источника (15-отечественных и 59 зарубежных). Диссертация иллюстрирована 7 рисунками, 18 таблицами.

Содержание работы
Материалы и методы

Для решения поставленных задач нами были обследованы 53 ребенка первого года жизни, оперированных по поводу сложных врожденных пороков сердца в Научном центре сердечно-сосудистой хирургии им.А.Н.Бакулева РАМН в отделении Экстренной хирургии новорожденных и детей первого года жизни (заведующий, д.м.н. проф. В.Н.Ильин) (табл. 1).

Больные были разделены на две основные группы. Одну группу составили 38 пациентов с ВПС, которым оперативные вмешательства выполнялись в условиях ИК, другую-15 детей, оперированные без использования ИК.
Таблица 1

Анатомическая характеристика врожденных пороков сердца у обследуемых пациентов

Виды врожденных пороков сердца	Число наблюдений
Общий открытый атриовентрикулярный канал	5
Атрезия легочной артерии	2
Дефект межжелудочковой перегородки	8
Дефект межжелудочковой перегородки с коарктацией аорты	2
Дефект межпредсердной перегородки	2
Транспозиция магистральных артерий	9
Двойное отхождение сосудов от правого желудочка	5
Единственный желудочек сердца	3
Множественные дефекты межжелудочковой перегородки	4
Открытый артериальный проток	1
Тотальный аномальный дренаж легочных вен	3
Тетрада Фалло	6
Коарктация аорты (изолированная)	3

В дальнейшем пациенты каждой из указанных групп распределялись с учетом следующих признаков: возраст, вес, анатомическая характеристика порока, респираторые осложнения.

Возраст детей варьировал от 1 до 390 дней, масса тела составляла от 2,0 кг до 9,7 кг (табл. 2).

Таблица 2

Распределение пациентов с учетом условий операции, возраста и веса тела

Группы пациентов	с ИК (n=38)	без ИК (n=15)	Всего (n=53)
Возраст (дни)	194,5 (1-390)	91,92 ± 53,66 (7-210)	170,1 ± 11,42 (1-390)
1-30 дней	5	2	7
30-60 дней	2	6	8
60-360 дней	31	7	38
Вес, кг	5,86 ±1,63 (2,6-9,1)	4,2 (2-9,7)	5,59 ± 1,81 (2-9,7)

Примечание: ИК – искусственное кровообращение
Для получения ТБС использовали модифицированный нами катетер с ловушкой (рис. 1). Особенностями конструкции является наличие ловушки малого диаметра, что обеспечивает скопление анализируемого материала в основном на ее дне, а не на стенках. Это дает возможность более полно использовать материал, поскольку облегчается перенос содержимого ловушки для последующего исследования.


3

1

2

Рис. 1. Система для забора трахеобронхиального смыва у детей первого года жизни

1. 
   коннектор для присоединения к вакуумному отсосу
   
2. 
   аспирационная часть катетера
   
3. 
   ловушка
   

Исследование состава ТБС проводили в камере Горяева после окраски 1% раствором трипанового синего, при которой все нежизнеспособные клетки окрашиваются в голубой или синий цвет, а жизнеспособные остаются неокрашенными.

Этот метод позволяет подсчитать:

1. 
   Общее число клеток в 1 мл ТБС, т.е. клеточность (табл. 3).
   
2. 
   Число различных клеток (альвеолярных макрофагов, лимфоцитов, нейтрофильных лейкоцитов, эритроцитов) в 1 мл.
   
3. 
   Число жизне – и нежизнеспособных альвеолярных макрофагов, лимфоцитов (табл. 3).
   

Таблица 3

Клеточность, число жизнеспособных и нежизнеспособных альвеолярных макрофагов в трахеобронхиальном смыве детей до и после операции по поводу врожденных пороков сердца

Операции в условиях искусственного кровообращения
Пациент	Время получения смывов	Клеточность в 1 мл х 10³	Альвеолярные макрофаги
			Общее число в 1 мл х 10³	Жизнеспособные		Нежизнеспособные
				в 1 мл х 10³	в % к общему числу	в 1 мл х 10³	в % к общему числу
Г-о	до операции	35,0	30,0	15,0	50,0	15,0	50,0
	после операции	117,0	37,5	15,0	40,0	22,5	60,0
М-в	до операции	80,0	55,0	0	0	55,0	100,0
	после операции	235,0	27,0	2,5	9,1	25,0	90,1
Ц-в	до операции	180,0	167,0	112,5	68,2	55,0	32,8
Т-н	после операции	207,0	57,5	17,5	30,4	40,0	69,9
М-в	до операции	287,5	170,0	92,5	54,5	77,5	45,6
	после операции	195,0	80,0	52,5	65,5	27,3	34,4
Ч-в	до операции	210,0	27,5	7,5	27,5	20,0	72,7
	после операции	215,0	47,5	20,0	42,1	27,5	57,9
М-а	до операции	37,5	25,0	0	0	25,0	64,3
Г-к	до операции	95,0	35,0	12,5	35,7	22,5	64,3
	после операции	105,0	42,5	12,5	29,4	30,0	70,6
Операции без искусственного кровообращения
С-в	до операции	137,5	20,0	10,0	50,0	10,0	50,0
	после операции	162,5	12,5	7,5	60,0	5,0	40,0
Г-в	до операции	85,0	35,0	10,0	28,6	25,0	71,4
	после операции	237,5	90,0	62,5	69,4	27,5	30,6

Одновременно с исследованием ТБС в камере Горяева готовили монослойные нецентрифугированные цитологические препараты по оригинальной методике (Романова Л.К, Младковская Н.И, 1984). Препараты окрашивали по Романовскому–Гимза. В каждом случае для составления эндопульмональной цитограммы (ЭПЦ) (процентное соотношение различных клеточных элементов внутренней среды органов дыхания) просматривали, как правило, 500 клеток при увеличении х 1000 (иммерсия). При составлении ЭПЦ учитывали альвеолярные макрофаги, моноциты, лимфоциты, нейтрофильные лейкоциты. Клетки бронхиального эпителия и эритроциты в ЭПЦ не включали. Термин “Эндопульмональная цитограмма“ был предложен в 1982 году (Авцын А.П. и др, 1982).

Процессы деструкции альвеолярных макрофагов оценивали количественно, выражая в % число нежизнеспособных клеток по отношению к жизнеспособным альвеолярным макрофагам (табл. 3).

Для выявления системного и местного воспаления в легких использовали иммуноферментный метод обнаружения провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-8. Функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов оценивали по содержанию нейтрофильной эластазы и α1-антитрипсина. При этом исследование проводили как в ТБС, так и в сыворотке крови.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel 2002 (Microsoft Corp) и Statistica 6.0 (Statsoft).

Распределение данных с числом наблюдений более 50 оценивали по тесту Lillliefors, с числом наблюдений менее 50 – по критерию Shapiro-Wilks. Распределение считали нормальным или близким к нормальному при значениях Lilliefors p>0,2 и Shapiro-Wilks p>0,1. Для параметрических данных определяли среднее арифметическое ± стандартное отклонение, минимум и максимум вариационного ряда. Для непараметрических количественных данных вычисляли медиану, минимум и максимум вариационного ряда, для качественных признаков – долю.

Для выявления и оценки характера связи между признаками с нормальным распределением использовали регрессионный анализ и коэффициент корреляции Пирсона, для непараметрических данных - коэффициенты корреляции Спирмена и Кендалла.

Для анализа качественных признаков использовали критерий χ²; если абсолютные частоты не превышали 5, применяли точный тест Фишера, для анализа повторных измерений - критерий Мак-Нимара.

Для выявления различий в группах с количественными параметрическими данными применяли t-тест, однофакторный и многофакторный дисперсионные анализы и дисперсионный анализ повторных измерений.

Непараметрические данные анализировали с помощью критериев Манна-Уитни и Крускала-Уоллиса, для оценки повторных измерений применяли критерии Уилкоксона и дисперсионный анализ Фридмана.

Достоверными считали различия при р< 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение

При обследовании детей, оперированных в условиях ИК, нами были выделены три подгруппы анатомических вариантов врожденных пороков сердца. Большая часть пациентов имела сложные врожденные пороки сердца (транспозиция магистральных сосудов, двойное отхождение сосудов от правого желудочка, Тетрада Фалло и др.) – 68,43%, дефекты межпредсердной или межжелудочковой перегородок составляли 23,68%, пациентов с множественными дефектами межжелудочковой перегородки оказалось 7,89% (табл. 1).

Сравнение детей, отличающихся типами септальных дефектов, не выявило существенных различий по ряду признаков (критерий Манна-Уитни, однофакторный дисперсионный анализ, точный тест Фишера). Учитывая последнее, а также малочисленность детей с множественными дефектами межжелудочковой перегородки, мы решили объединить данные по этим разновидностям анатомических вариантов.

Возраст детей варьировал от 1 до 390 дней. В возрасте от момента рождения до 30 дней были обследованы 5 (13,88%) детей, от 30 до 60 дней–2 ребенка (5,56%), от 60 дней и старше–31 ребенок (80, 56%).

У детей с дефектами межжелудочковой перегородки возраст варьировал от 70 до 390 дней, вес – от 4 до 7,8кг. У детей со сложными ВПС возраст составлял от 1 до 380 дней, вес – от 2,6 до 9,1кг. Отсутствие респираторных осложнений отмечено у 10 пациентов. 16 младенцев были выписаны из стационара без послеоперационных осложнений.

Дыхательная недостаточность различного генеза отмечена у 8 больных.

Диагноз пневмонии был поставлен у 4 пациентов.

В послеоперационном периоде умерло 3-е детей. Один из пациентов умер в 1-е сутки после операции.

В зависимости от характера легочного кровотока были выделены пациенты с усиленным легочным кровотоком (n=20) и с обедненным легочным кровотоком.

В табл. 4 отражено количество введенного в трахею физиологического раствора и полученных ТБС у детей до и после операции по поводу ВПС. Количество полученного ТБС у разных детей варьирует от 5% до 70% от введенного физиологического раствора. Это можно отчасти объяснить состоянием воздухоносных путей: в момент забора ТБС при наличии спазма бронхов количество жидкости ограничено.

Таблица 4

Количество введенного физиологического раствора и полученных трахеобронхиальных смывов детей до и после операции по поводу врожденных пороков сердца

Пациент	Время получения смыва	Условия операции	Введено физ. р-ра в мл	Получено ТБС в мл	% ТБС от введенного р-ра
Д-в	до операции	ИК	1,0	0,3	30,0
С-н	до операции	ИК	2,0	0,3	15,0
М-в	до операции	ИК	5,0	1,7	34,0
М-а	до операции	ИК	5,0	-	-
К-в	после опер	ИК	1,0	0,7	70,0
М-о	после опер	ИК	1,5	0,5	33,3
С-в	после опер	ИК	1,0	0,05	5,0
Т-н	после опер	ИК	5,0	4,0	80.0
Г-о	до операции	ИК	5,0	-	-
	после опер	ИК	5,0	2,5	50,0
Ц-в	до операции	ИК	4,0	0,5	12,5
	после опер	ИК	4,0	-	-
М-в	до операции	ИК	3,0	0,5	16,6
	после опер	ИК	4,0	0,6	15,0
Ч-в	до операции	ИК	4,0	0,5	12,5
	после опер	ИК	4,0	0,4	10,0
Г-к	до операции	ИК	4,0	0,4	10,0
	после опер	ИК	4,0	0,5	12,5
С-в	до операции	Без ИК	2,0	1,0	50,0
С-в	до операции	Без ИК	4,0	0,7	17,5
	после опер	Без ИК	4,0	0,5	16,6
Г-в	до операции	Без ИК	3,0	0,5	16,6
	после опер	Без ИК	3,0	0,7	23,3
Среднее значение					26,3

Примечание: ИК – искусственное кровообращение

ТБС – трахеобронхиальный смыв.

При цитологическом исследовании в микропрепаратах ТБС непосредственно перед операцией обнаружены альвеолярные макрофаги (АМ), нейтрофильные лейкоциты (Н), эпителий ротовой полости (рис.2, 3, 4, 5).


Рис. 3. Монослойный цитологический препарат трахеобронхиального смыва ребенка первого года жизни после операции. Окраска по Романовскому-Гимза. Увеличение х 1000.

АМ

АМ

Н

АМ

Н

Рис. 2. Монослойный цитологический

препарат трахеобронхиального смыва

ребенка первого года жизни до операции.

Окраска по Романовскому-Гимза.

Увеличениие х 1000.

АМ

Н

АМ

Н

Р

Рис. 5. Монослойный цитологический препарат трахеобронхиального смыва ребенка первого года жизни после операции. Окраска по Романовскому-Гимза. Увеличение х 1500.
ис. 4. Монослойный цитологический

препарат трахеобронхиального смыва

ребенка первого года жизни до операции.

Окраска по Романовскому-Гимза.

Увеличениие х 1500.

Сразу после операции на микропрепарате ТБС большую часть поля зрения занимают нейтрофильные лейкоциты (рис.4,5).

Таблица 5

Клеточность и число жизнеспособных и нежизнеспособных альвеолярных макрофагов в трахеобронхиальных смывах детей до и после операций по поводу врожденных пороков сердца

Время получения смыва	Клеточность х10³ Кл/мл	Число альвеолярных макрофагов
		общее в 1 мл х 10³	Жизнеспособных		нежизнеспособных
			в 1 мл х 10³	%	в 1 мл х 10³	%
С искусственным кровообращением
До операции n=6	138,3±82,6	79,2±56,2	37,9±40,6	33,3±23,2	41,2±19,9	66,8±22,9
После операции n=5	194,0±39,6	50,0±17,7	21,5±16,3	37,5±17,9	28,5±5,9	62,6±17,9
Без искусственного крвообращения
До операции n=2	111,2±51,4	27,5±14,7	10,0±0	39,3±20,9	17,5±14,7	60,7±20,9
После операции n=2	950±1396,4	51,2±75,9	35,0±53,9	64,7±9,2	16,2±22,0	35,3±9,2

Обнаружено, что у детей, оперированных с ИК, относительное число жизнеспособных АМ до и после операции достоверно не отличается. Относительное число нежизнеспособных АМ также не изменяется после операции по сравнению с дооперационными значениями (табл. 5).

Уровни ИЛ–6 и ИЛ–8 в сыворотке крови повышаются сразу после окончания ИК и к 3-м суткам снижаются до значений, сопоставимых с исходными. Однофакторный дисперсионный анализ Фридмана выявил достоверные изменения содержания в сыворотке крови ИЛ–8 и ИЛ–6 после окончания ИК (p<0,039). При этом достоверно значимым оказалось только повышение содержания в сыворотке крови ИЛ–8 (р=0,0004) и ИЛ–6 (p=0,003) сразу после прекращения ИК по сравнению с дооперационными значениями (парный крит. Уилкоксона). Динамика изменений уровней интерлейкинов на 3-и сутки по сравнению с до- и послеоперационными значениями статистически недостоверна (парный крит. Уилкоксона, все р>0,05). Обнаружено, что уровень ИЛ-8 после операции у больных с пневмонией, дыхательной недостаточностью достоверно выше, чем у пациентов с неосложненным течением послеоперационного периода (крит. Крускала-Уоллиса р=0,036, крит. Манна-Уитни по пневмонии р=0,028, по осложнениям р=0,019).

Выявлены достоверные различия (р=0,02) в уровнях ИЛ–6 в сыворотке крови до операции у детей с обедненным легочным кровотоком по сравнению с пациентами с обогащенным легочным кровотоком.

По нашему мнению, показатели содержания интерлейкинов в крови более информативны для характеристики системного воспаления, чем показатели клинического (цитологического) анализа крови.

В таблицах 6 и 7 представлен клеточный состав ТБС детей первого года жизни с ВПС, оперированных с ИК и без ИК. Отмечено снижение числа альвеолярых макрофагов (АМ) после операции как с ИК так и без ИК. Можно видеть, что как в случаях с ИК, так и без ИК после операции резко возрастает число нейтрофильных лейкоцитов (Н). Число лимфоцитов несколько снижено, но эти данные недостоверны. Таким образом, наблюдается проявление легочной воспалительной реакции на цитологическом уровне.

Таблица 6

Клеточный состав трахеобронхиальных смывов детей первого года жизни с врожденными пороками сердца, оперированных без искусственного кровообращения

Этапы исследования	Клеточный состав ТБС (%)			Число случаев
	АМ+МОН	Н	Л
До операции	52,2±27,5*	13,9±15,9**	17,3±13,5	4
После операции	11,0±10,5*	84,1±10,9**	3,3±3,3	4

Примечание: АМ+МОН – альвеолярные макрофаги +моноциты

Н – нейтрофильные лейкоциты

Л – лимфоциты

* - статистически различаются (t–тест=0,05)

** - статистически различаются (t–тест=0,0006)

Таблица 7

Клеточный состав трахеобронхиальных смывов детей первого года жизни с врожденными пороками сердца, оперированных в условиях искусственного кровообращения

	Клеточный состав ТБС (%)			Число случаев
	АМ+МОН	Н	Л
До операции	76,0±11,5*	16,5±12,1**	7,2±3,0	10
После операции	35,7±18,2*	58,69±18,6**	5,3±2,7	11

Примечание: АМ+МОН – альвеолярные макрофаги +моноциты

Н – нейтрофильные лейкоциты

Л – лимфоциты

* - статистически различаются (t–тест=0,0019)

** - статистически различаются (t–тест=0,0016)
Нами были исследованы сыворотки крови на наличие нейтрофильной эластазы (НЭ) и α1-антитрипсина (АТ) у 8 пациентов, оперированных в условиях искусственного кровообращения. Наши результаты расходятся с данными работы Бокерии Л.А., Самуиловой Д.Ш. (2006), где показана тенденция к увеличению уровня НЭ после операции с ИК у пациентов различного возраста. Однако, нами отмечено снижение НЭ после операции (р<0,05). Концентрация α1-АТ в сыворотке крови после операции также достоверно уменьшается (р<0,05).

Нами были определены уровни ИЛ-6 в 12, ИЛ-8 в 13 пробах ТБС (рис.4). Анализ результатов показал достоверное увеличение концентрации ИЛ-6 в ТБС по сравнению с дооперационными значениями (р=0,033). Различий в уровнях ИЛ-8 до и после операции не обнаружено. Однако выявлено близкое к достоверному увеличение концентрации ИЛ-8 в ТБС после операции у детей с респираторными осложнениями (n=3) по сравнению с детьми без респираторных осложнений (n=9) (критерий Манна-Уитни р=0,07).

Рис. 4 Концентрации (пг/мл) провоспалительных цитокинов в трахеобронхиальном смыве у детей первого года жизни, оперированных в условиях ИК

1 – ИЛ-6 в ТБС до операции

2 – ИЛ-6 в ТБС после операции

3 – ИЛ-8 в ТБС до операции

4 – ИЛ-8 в ТБС после операции

Рис. 5 Концентрации (пг/мл) провоспалительных цитокинов в сыворотке крови у детей первого года жизни, оперированных в условиях ИК.

1-ИЛ-6 до операции

2-ИЛ-6 после операции

3-ИЛ-6 на 3-и сут после операции

4-ИЛ-8 до операции

5-ИЛ-8 после операции

6-ИЛ-8 на 3-и сут после операции

Изменение уровней провоспалительных цитокинов в сыворотке крови у детей первого года жизни, оперированных с ИК, отражено на рис. 5. Можно видеть достоверное увеличение уровней ИЛ-6 и ИЛ-8 непосредственно после операции.

Особенностями пациентов, оперированных без ИК, явилось развитие почти у половины из них (46,67%) респираторных осложнений. При этом диагноз пневмонии был поставлен в 40% случаев, а дыхательной недостаточности – в 6,67%. Такие данные, по нашему мнению, связаны с исходной тяжестью состояния пациентов, которым не удается выполнить радикальную коррекцию ВПС первым этапом. Летальность в этих случаях составляет 6,67%.

У детей с респираторными осложнениями и пневмонией достоверно возрастает концентрация ИЛ-8 в сыворотке крови после операции по сравнению с детьми, у которых не наблюдались осложнения со стороны дыхательной системы.

Выводы

1. 
   У детей первого года жизни с врожденными пороками сердца непосредственно после операции по сравнению с дооперационным уровнем в трахеобронхиальных смывах достоверно возрастает относительное количество нейтрофильных лейкоцитов на 40,09%. Это отражает проявления воспалительного процесса в легких.
   
2. 
   После операции на сердце в условиях искусственного кровообращения развилась пневмония в 9,5% случаев. У этих пациентов отмечено повышение уровня ИЛ-6 и ИЛ-8 в сыворотке крови. Следовательно, искусственное кровообращение может служить фактором риска развития воспаления в легких.
   
3. 
   Достоверное уровня ИЛ-6 в сыворотке крови и в трахеобронхиальном смыве у детей первого года жизни после операции происходит синхронно. Это указывает на однонаправленное проявление общей и местной (легочной) воспалительной реакции.
   
4. 
   Предложен и апробирован оригинальный катетер с ловушкой для получения трахеобронхиального смыва у детей первого года жизни. Использование этого катетера позволяет получить достаточное количество материала для цитологического исследования и иммуноферментного анализа с целью выявления системного и местного (легочного) воспаления.
   
5. 
   Повышение уровней провоспалительных цитокинов в крови наблюдается не только в условиях искусственного кровообращения, но и при оперативном вмешательстве на сердце и сосудах без искусственного кровообращения, в связи с чем, можно считать, что само оперативное вмешательство способствует развитию легочного воспаления.
   

Практические рекомендации

1. 
   Использование методики получения и анализа эндопульмональной цитограммы в раннем послеоперационном периоде может существенно улучшить прогнозирование развития дыхательных осложнений.
   
2. 
   Изучение уровней цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8, НЭ и α1-АT в сыворотке крови и в ТБС способствует лучшему пониманию механизмов развития воспалительной реакции как местно (в легких) так и в организме в целом.
   
3. 
   Изучение развития воспалительной реакции после ИК может способствовать выработке мер, направленных на ослабление негативных последствий операции.
   

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. 
   А.В.Трепаков, Л.А.Бокерия, Л.К.Романова Клеточный состав трахеобронхиальных смывов у новорожденных после операции с искусственным кровообращением//Материалы Четвертого Всемирного Конгресса по Детской Кардиологии и Кардиохирургии Аргентина, (Буэнос-Айрес) 2005г. Тез.докл. - С. 1014
   
2. 
   Л.А.Бокерия, А.В.Трепаков, Л.К.Романова, В.Н.Ильин, Л.Ф.Макарова, Р.С.Бугрилова, Л.А.Ведерникова. Клеточный состав трахеобронхиальных смывов у детей первого года жизни с ВПС до и после операций с искусственным кровообращением//Материалы Девятой ежегодной сессии НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых 2005г. Тез.докл. - С. 31
   
3. 
   А.В.Трепаков, Л.А.Бокерия, Л.К.Романова, Л.Ф.Макарова, Р.С.Бугрилова, Н.А.Гукасова, А.С.Фадеева Уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8, активность нейтрофильной эластазы и α1-протеиназного ингибитора в плазме крови и трахеобронхиальных смывах у младенцев с врожденными пороками сердца, оперированных в условиях искусственного кровообращения//Материалы Десятой ежегодной сессии НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН с Всероссийской конференцией молодых ученых 2005г. Тез.докл. - С. 115
   
4. 
   А.В.Трепаков, Л.К.Романова, Н.А.Гукасова Уровень интерлейкина-8 (ИЛ-8) в периферической крови у младенцев оперированных по поводу врожденных пороков сердца (ВПС) с искусственным кровообращением (ИК) и без него//Материалы Международного конгресса “ Иммунитет и детские болезни: от теории к терапии” Россия, Москва, 2005 С. 19-20
   
5. 
   Л.А.Бокерия, А.В.Трепаков, Л.К.Романова, Л.Ф.Макарова, Н.А.Гукасова, Р.С.Бугрилова Маркеры воспаления ИЛ-6, ИЛ-8, нейтрофильная эластаза и α1-протеиназный ингибитор в плазме крови и в трахеобронхиальных смывах у грудных детей после операции на открытом сердце//Материалы Всероссийского съезда патологоанатомов Россия, Москва, 2006. С. 56-61
   
6. 
   А.В.Трепаков, Л.К.Романова, Л.Ф.Макарова, Н.А.Гукасова, Р.С.Бугрилова. Уровень провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-8 в трахеобронхиальных смывах и в сыворотке крови у младенцев с врожденными пороками сердца, оперированных в условиях искусственного кровообращения//Материалы 5 Российского Конгресса”Современные технологии в педиатрии и детской хирургии” Россия, Москва, 2006 С.115
   
7. 
   Л.А.Бокерия, А.В.Трепаков, Л.К.Романова, В.Н.Ильин, Л.Ф.Макарова, Н.А.Гукасова, Р.С.Бугрилова, Н.В.Шкарина, Л.А.Ведерникова Цитокины (ИЛ-6, ИЛ-8), нейтрофилы трахеобронхиального смыва и сыворотки крови как признаки воспалительной реакции у младенцев с врожденными пороками сердца при хирургическом лечении//Бюллетень НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН “Сердечно-сосудистые заболевания” 2007.C.84-90
   
8. 
   А.В.Трепаков, Л.А.Бокерия, Л.К.Романова Количество нейтрофилов, концентрация цитокинов и эластазы это послеоперационные маркеры развития пневмонии//Материалы 25 съезда Европейского общества интенсивной терапии, Германия, Берлин, 2007 С. 204
   
9. 
   А.В.Трепаков, Л.К.Романова, Л.А.Бокерия, Н.А.Гукасова, Л.Ф.Макарова, Р.С.Бугрилова. Общая и местная (легочная) воспалительная реакция у детей первого года жизни, оперированных по поводу врожденных пороков сердца (ВПС)//Материалы Научно-практической конференции и школы по инфекционной патологии (с международным участим), Москва, 2007 С.102-103
   
10. 
    Л.К.Романова, Л.А.Бокерия, А.В. Трепаков, Л.Ф. Макарова, Н.В. Гукасова, Р.С.Бугрилова Признаки общего и легочного воспаления у детей первого года жизни, оперированных по поводу врожденных пороков сердца// Иммунология №1, 2008 С. 41-45
    

Соискатель Трепаков А.В.
Выражаю искреннюю благодарность своим учителям профессорам Лидии Константиновне Романовой и руководителю отделения экстренной хирургии новорожденных и детей первого года жизни НЦССХ им.А.Н.Бакулева РАМН Владимиру Николаевичу Ильину. Огромная признательность за помощь в проведении исследования анестезиологам Л.А.Ведерниковой, Н. В.Шкариной, врачу-перфузиологу С.Н.Сонновой, врачу-реаниматологу А.Ф.Манеровой, старшей сестре отделения стерилизации О.Г.Пономаревой; сотрудникам отделения гематологии Е.Ф.Козар, З.Л.Коржановской, Н.Н.Самсоновой, Д.Ш.Самуиловой; сотрудникам лаборатории пульмонологии ГУ НИИ морфологии человека Л.Ф.Макаровой, Р.С. Бугриловой, Н.В.Гукасовой, А.Д.Сибирцеву. Благодарю сотрудников отделения Экстренной хирургии новорожденных и детей первого года жизни НЦ ССХ им.А.Н.Бакулева за понимание и повседневную помощь, которую они оказывали при выполнении моей научной работы. Отдельная благодарность и признательность моим родителям за неоценимую постоянную помощь и всяческую поддержку.